Chrzest przyjął dopiero, gdy miał 20 lat. To był punkt zwrotny w jego dotychczasowym życiu. Wstąpił do stanu duchownego. Jako lektor uczestniczył w służbie liturgicznej u boku biskupa Antiochii, Melecjusza. Jednak po śmierci matki (372) opuścił Antiochię i udał się na pustkowie, by tam prowadzić życie ascetyczne. W grocie spędził 4 lata. Zbyt surowe życie tak dalece nadwyrężyło mu zdrowie, że musiał pustynię opuścić. Powrócił więc do Antiochii, gdzie ponownie pełnił obowiązki lektora (378), a potem diakona (381). Święcenia kapłańskie przyjął w roku 385, gdy miał już ok. 36 lat.

W roku 387 w Antiochii wybuchły rozruchy przeciwko cesarzowi, Teodozemu I Wielkiemu. Rozjuszony tłum zaczął rozbijać pomniki cesarza, co wywołało ze strony władz represje. Wtedy to Jan wygłosił słynne Mowy wielkopostne, w których zganił popędliwość ludu, a równocześnie wstawiał się za nim. Wpłynął także na biskupa Antiochii, Flawiana, by ten osobiście wstawił się za swoim ludem u cesarza. Cesarz ogłosił amnestię i zakazał swojemu namiestnikowi represji. To zjednało Janowi wielką wdzięczność ludu i przydomek Złotousty (Chryzostom). Na jego kazania przybywały tłumy.

W roku 397 zmarł patriarcha Konstantynopola. Urząd ten cesarz ofiarował Janowi. Konsekrowany na biskupa przez patriarchę Aleksandrii, Jan z całym zapałem wziął się do pracy dla dobra swojej owczarni. Udało mu się najpierw pojednać ze Stolicą Apostolską biskupa Antiochii, Flawiana. W ten sposób zakończyła się przykra schizma z Rzymem. Na swoim dworze Jan zniósł wszelki przepych, jakim dotąd otaczali się jego poprzednicy. Zachęcał swoje duchowieństwo do podobnej reformy. Lud zjednał sobie wspaniałymi kazaniami, jakie regularnie głosił, i troską o potrzeby zwykłych ludzi. Piętnował nadużycia, nie szczędząc także dworu cesarskiego. Dla ubogich i bezdomnych wystawiał gospody i schroniska. Użyczył azylu nawet ministrowi cesarskiemu, kiedy ten popadł w niełaskę. Wysyłał misjonarzy na obszary objęte przez Arabów.

Tradycja przypisuje św. Janowi Chryzostomowi autorstwo jednej z form celebracji Boskiej Liturgii, nazywanej jego imieniem, która do dziś jest praktykowana w obrządku bizantyjskim. Jest to tzw. zwyczajna (czyli odprawiana przez większą część roku) liturgia prawosławna i grekokatolicka.

Z czasem pojawili się przeciwnicy radykalnego patriarchy. Duchowni mieli mu za złe, że zbyt wiele od nich wymagał; klasztory - że wprowadzał w nich pierwotną karność, a zwalczał rozluźnienie obyczajów. Ponadto Jan naraził się na gwałtowne ataki ze strony św. Epifaniusza tym, że dał u siebie schronienie zwalczanym zwolennikom nauki Orygenesa. Zarzucano mu, że okazuje jawnie sympatię dla Orygenesa. Najwięcej kłopotów wywołało jednak to, że Jan zaatakował w swoich kazaniach zbyt swobodne życie dworu cesarskiego, przede wszystkim cesarzowej Eudoksji. Z polecenia cesarzowej zwołano pod Chalcedonem synod, zwany później synodem "Pod Dębem" (nazwa wywodzi się od miejscowości Onercia - Dąb). Wrogowie Jana pod przewodnictwem patriarchy Aleksandrii, Teofila, posunęli się do tego, że usunęli Jana z urzędu patriarchy, a cesarzowa skazała go na banicję. Wywieziono go do Prenetos w Bitynii. Lud jednak tak gwałtownie wystąpił w obronie swego pasterza, że cesarzowa była zmuszona przywrócić biskupowi wolność.

Spokój trwał jednak krótko. Cesarzowa kazała wystawić sobie pomnik przed samą katedrą Mądrości Bożej, gdzie urządzano krzykliwe festyny i zabawy, nie licujące ze świętym miejscem. Jan potępił to w kazaniu z całą stanowczością. W odwecie cesarzowa zwołała do Konstantynopola synod swoich zwolenników, który ponownie deponował Jana. Na mocy orzeczeń tegoż synodu, w roku 404, cesarzowa skazała Jana na wygnanie. Wśród szykan i niewygód prowadzono go do Cezarei Kapadockiej, stąd do Tauru, wreszcie do Pontu nad Morzem Czarnym. Zima była bardzo surowa, co wymagało od biskupa szczególnego hartu. On jednak nie załamał się. Pisał listy do papieża oraz do wpływowych i wiernych sobie osób. Papież pięknym listem pochwalił bohaterstwo Chryzostoma i wysłał legatów w jego obronie do Konstantynopola. Dwór cesarski jednak ich nie przyjął.

Jan Złotousty zmarł w drodze, w mieście Comana, 14 września 407 r. Już w roku 428 Kościół w Konstantynopolu obchodził doroczną pamiątkę św. Jana Chryzostoma. W roku 438, na żądanie patriarchy stolicy cesarstwa - św. Proklusa, cesarz Teodozy II nakazał sprowadzić relikwie Chryzostoma. 27 stycznia 438 r. triumfalnie witał je Konstantynopol. Ciało złożono w kościele Dwunastu Apostołów. W roku 1489 sułtan turecki Bajazed II podarował te relikwie królowi francuskiemu Karolowi VIII. Od roku 1627 relikwie znajdują się w Rzymie, w bazylice św. Piotra, w kaplicy Najświętszego Sakramentu. Ponadto relikwie św. Jana Chryzostoma znajdują się dzisiaj także na Górze Athos, w Brugii, Clairvaux, Dubrowniku, Kijowie, Maintz, Messynie, Moskwie, Paryżu i Wenecji.

Jan pozostawił po sobie ogromną spuściznę literacką: kanon liturgii świętej (Boska Liturgia św. Jana Złotoustego), liczne pisma teologiczne (traktaty o naturze boskiej i ludzkiej Jezusa, o Eucharystii - jako identycznej ofierze z ofiarą na Krzyżu, o prymacie papieskim, O kapłaństwie, O wychowaniu syna oraz Przeciwko Żydom i poganom), kazania, które są w znacznej mierze komentarzem do Pisma świętego, mowy i szeroką korespondencję (w tym 17 listów do św. Olimpii, diakonisy). Jan Złotousty wyróżniał się przede wszystkim jako znakomity znawca pism św. Pawła Apostoła. Całość dzieł Chryzostoma obejmuje kilka opasłych tomów.

Św. Jan Chryzostom należy do czterech wielkich doktorów Kościoła wschodniego (obok św. Bazylego, św. Grzegorza z Nazjanzu i św. Atanazego). Na Wschodzie cieszy się tak wielkim kultem, że jego imię wspomina się w roku liturgicznym kilka razy. Papież Pius V ogłosił go doktorem Kościoła (1568). Jest patronem kaznodziejów i studiujących teologię oraz orędownikiem w sytuacjach bez wyjścia.

W ikonografii św. Jan Chryzostom przedstawiany jest jako patriarcha w stroju rytu ortodoksyjnego (z dużymi krzyżami), czasami jako biskup Kościoła katolickiego, zazwyczaj z krótką, niekiedy spiczastą bródką i łysiną czołową. Prawą rękę ma uniesioną w błogosławieństwie, w lewej trzyma Ewangelię. Niekiedy wyobrażany jest z krzyżem w dłoni. W ikonografii często spotykany jest na ikonach "Trzech Wielkich Hierarchów" razem ze św. Bazylim Wielkim i św. Grzegorzem Teologiem, spośród których wyróżnia się przede wszystkim najkrótszą brodą.

W sztuce zachodniej jego atrybutami są: księga, osioł, pisarskie pióro.